Pharmaceutical Technology Ed. 173

Pharmaceutical Techno logy 49 EdiciónSudamérica 2021 - N º173 Flujo de trabajo del ensayo FIGURA 1 feroides multitumorales 3D Incucyte® para estudiar el crecimiento de multies- feroides tumorales 3D en cocultivo con fibroblastos o células inmunes, captu- rando datos que pueden ser omitidos por métodos de punto de tiempo único. La adquisición de imágenes con pro- fundidad de foco mejorada Brightfield (DF Brightfield) permite obtener imáge- nes a largo plazo de múltiples esferoides tumorales cultivados en un lecho de matriz extracelular (Matrigel™). Esta adquisición de imágenes su- perior da como resultado imágenes de campo claro con alto contraste que se pueden enmascarar fácilmente utilizan- do las definiciones de procesamiento de Incucyte® integradas. El tamaño, el recuento y la excentricidad del objeto de campo claro se trazan automáticamente a lo largo del tiempo para ofrecer una gran cantidad de información sobre la formación de esferoides y las tasas de crecimiento. Se pueden adquirir, analizar y graficar miles de imágenes, con la capacidad de ejecutar hasta seis placas de 96 pocillos en paralelo para aumentar el rendimiento. A continuación, presentamos mé- todos de validación y datos que de- muestran la capacidad del sistema de análisis de células vivas Incucyte® para visualizar y cuantificar cinéticamente el impacto de las células estromales en la morfología y la sensibilidad de múltiples esferoides tumorales a los agentes quimioterapéuticos, así como para evaluar las células inmunitarias mediadas y toxicidad dentro de mul- tiesferoides tumorales. Material y métodos 1. Placa de microtitulación de 96 po- cillos recubierta con una capa de Matrigel ™ (Corning) (40 μL / pocillo, diluido en medio sin suero a una con- centración mínima de 4,5 mg / ml) y polimerizado a 37°C durante 30 min. 2. Células de interés recolectadas, contadas y sembradas en placas de 96 pocillos prerrevestidas a las densidades deseadas (150 o 100 μL / pocillo). a. Cocultivo de células tumorales y es- tromales: células tumorales y estro- males sembradas en una proporción de 1:1 (150 μL / pocillo, 75 μL de cada tipo de célula). b. Cocultivo de células tumorales e in- munes: células tumorales sembradas solas (100 μL / pocillo). 3. Monitoreo de la formación de múltiples esferoides durante 3 días utilizando un sistema de análisis de imágenes Incucyte® (adquisición DF® Brightfield, aumento de 10X, cada 6 h). 4. Después de la formación de múltiples esferoides, las células inmunes de interés se añaden al monocultivo tumoral en una relación efecto-ob- jetivo optimizada (E:T) en un volumen de 50 μL / pocillo. 5. Se añaden los tratamientos apro- piados a las placas de ensayo de cocultivo (50 μL / pocillo) a 4 veces la concentración final del ensayo para lograr un volumen final de 200 μL / pocillo. 6. Se controló la proliferación de múlti- ples esferoides en Incucyte® S3 (ex- ploración repetida de 6 h) hasta 10d. Todos los reactivos de cultivo celular se obtuvieron de Life Technologies a menos que se indique lo contrario. Los cultivos de MDA-MB-231 (ATCC), SK-BR-3 (ATCC) y SKOV3 (EACC) se transfectaron de manera estable con el reactivo Incucyte® Nuclight Red Lenti- virus (EF1 Alpha Promoter, selección de puromicina, nº de cat. Protocolo Bio- Science). Los cultivos de BT-474 (ATCC) se transfectaron de forma estable con el reactivo de lentivirus Incucyte® Cytolight Green (promotor alfa EF1, se- lección de puromicina, nº de cat. 4481, preparado según el protocolo de Essen BioScience). Lapatinib y la camptotecina se obtuvieron de Sigma, y ZK164015 se obtuvo de Tocris Bioscience. Se adquirieron fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) de CalTag Medsystems (nº de cat. ZHC-5102) y glóbulos rojos MCF7 Nuclight de Essen BioScience (nº de cat. 4524). Todas las líneas celulares se culti- varon en medio MEM suplementado con FBS al 10%, piruvato sódico al 1% más aminoácidos no esenciales al 1% y se cultivaron hasta la confluencia en matraces tratados con cultivo de tejidos de 75 cm 2 (Corning). Las células se recolectaron y se sem- braron en placas de 96 pocillos (Corning Nº 3595) recubiertas con una capa base de 40 μl / pocillo de Matrigel de manera que 3 d después de la siembra de células, se formaron multiesferoides con el tamaño deseado. La formación de esferoides se con- troló en un Incucyte® S3 durante 3 días a intervalos de 6 horas.