Pharmaceutical Technology Ed. 173

50 EdiciónSudamérica 2021 - N º173 Pharmaceutical Techno logy Observaciones morfológicas con imágenes Incucyte® DF-BF y cuantificación del tamaño de múl- tiples esferoides y crecimiento cinético mediante análisis en tiempo real. Se sembraron células SK-BR-3 en placas de 96 pocillos de fondo plano sobre un lecho de Matrigel en mono o cocultivo con NHDF (relación 1:1, 1000 células / pocillo para cada uno) y multiesferoides (MS) permitido formar (3 d). Imágenes de campo claro de profundidad de foco extendida de Incucyte® (campo claro de DF) (8 d después de la siembra de células) de SK-BR-3 MS en mono o cocultivo con NHDF. Máscara de contorno de campo claro mostrada en amarillo. Tenga en cuenta la influencia de los NHDF en la morfología y el tamaño de SK-BR-3 MS (área total). Los gráficos de curso temporal muestran el área de objeto de campo claro total de pozo indivi- dual (μm2) (eje y) a lo largo del tiempo (h) (eje x) e ilustran los perfiles de crecimiento cinético específicos del tipo de célula para una variedad de tumores de mama MS cocultivados con NHDF. Los datos se recogieron durante un período de 192 horas a intervalos de 6 horas. Cada punto de datos representa la media ± SEM, n = 15 pozos. FIGURA 2 Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de capas leucocíticas de donantes sanos usando medio de gradiente de densidad Lymphoprep™ (StemCell Te- chnologies) y se mantuvieron en RPMI 1640 complementado con FBS inactivado por calor al 10%. Influencia de las células estromales en la morfología multiesferoide Se demostró que los NHDF tienen un efecto sorprenden- te sobre la morfología de múltiples esferoides tumorales. Se sembraron células SK-BR-3 solas o con NHDF (relación 1:1, 1.000 células / pocillo para cada una) y se adquirieron imágenes de campo claro de DF cada 6 hs. En monocultivo, las células SK-BR-3 no lograron formar multiesferoides com- pactos; los co-cultivos con NHDF dieron comoresultado la formación de agregados más compactos (Figura 2). El módulo de software Incucyte® Spheroid permitió la cuantificación cinética de ambas morfologías, rastreando el crecimiento de múltiples esferoides a través de mediciones de tamaño (área total de BF). Además, se revelaron diferentes perfiles de crecimiento temporal a través del análisis de células vivas para un panel de cuatro multiesferoides de tumores de mama (MCF7, MDA-MB-231, SK-BR-3 y BT-474) cocultivados con NHDF ( Figura 2 gráfica del curso del tiempo). Curiosamente, los NHDF cocultivados con células MDAMB-231 (proporción 1:1, 1000 células / pocillo para cada uno), revelaron un efecto dependiente del tiempo sobre la morfología del esferoide. Los múltiples esferoides MDA- MB-231 pasaron de una apariencia estrellada y ramificada, evidente en los puntos de tiempo tempranos, a una apariencia redonda más agrupada después de 6 d (Figura 3). Ensayo de contracción y crecimiento multiesferoide de 96 pocillos para análisis farmacológico Para demostrar la aptitud de este cocultivo de células estromales y tumorales 3D para las pruebas de toxicidad de compuestos, se realizó un estudio farmacológico utilizando un panel de cuatro líneas de células tumorales de mama de uso común; MCF7, MDAMB-231, SK-BR-3 y BT-474. Las células se cultivaron conjuntamente con NHDF (relación 1:1, 1000 células / pocillo de cada uno) y se dejó que se formaran multiesferoides durante 3 días antes del tratamiento (hasta 10 d) con agentes citotóxicos y de tratamiento estándar, Lapatinib, ZK164015 y Camptotecina (CMP). Las vistas de vasos automatizadas en tiempo real de Incucyte® permitieron una visualización rápida de los efectos del tratamiento en el tamaño de múltiples esferoides (área total de BF). Las vistas de vasos de 96 pocillos de multiesferoides MCF7 con máscara de análisis de superposición y ciclos de tiempo de tratamiento ilustran una inhibición dependiente de la concentración de ZK164015 y CMP en el tamaño del esferoide (Figura 4).