Pharmaceutical Technology Ed. 163

28 Edición Sudamérica 2020 - N º163 Pharmaceutical Techno logy naron que los cambios estructurales dependían de la cantidad de proteína adsorbida, con más proteína nativa observada en muestras con adsorción máxima (17). Los autores teorizan que a concentraciones de adsorción más ba- jas, se forma una capa monomolecular en la que la confirmación de la proteína adsorbida se ve afectada por las pro- piedades de la superficie adyuvante y se desnaturaliza más. A niveles de adsorción más altos, la proteína está más débilmente ligada y puede retener la estructura nativa. Si bien el enfoque de los estudios de caracterización de vacunas absorbidas por aluminio radica en la estructura de antígeno proteico, quedan dudas sobre la aplicabilidad de los estudios a formulaciones de vacunas individuales y el impacto que las perturbaciones estructurales del antígeno pueden tener sobre la efectividad y la estabilidad de la vacuna a lo largo de la vida útil del producto. Orientación regulatoria para estudios de estabilidad de vacunas Existe poca orientación general so- bre los métodos de prueba de liberación y estabilidad para vacunas adsorbidas sobre aluminio. El documento de la FDA de EE.UU. , Orientación para la industria, contenido y el formato de la información de química, fabricación y controles e información de descripción del establecimiento para una vacuna o producto relacionado (18), establece que la identidad, la pureza y la potencia deben incluirse en las especificaciones de liberación del medicamento pero no proporciona métodos de prueba u orien- tación específicos. El Capítulo <1235> de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) Vacunas para uso humano – Con- sideraciones generales (19) no propor- ciona recomendaciones específicas para las pruebas de liberación y estabilidad más allá de los requisitos generales de pruebas de potencia, seguridad general, esterilidad, pureza, identidad y mate- riales constituyentes. Sólo había una monografía USP de vacuna adsorbida en aluminio disponible como ejemplo (Antrax Vaccine Adsorbed), pero ésta se eliminó a partir de agosto de 2018 (20). La monografía incluía pruebas realizadas en el filtrado estéril que no incluye aluminio. Las pruebas realizadas en el filtrado estéril incluyeron identi- dad mediante Western Blot, proteína total mediante el uso de un ensayo de Bradford según USP <1057> (21) y proteína de 83 kDa mediante elec- troforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). Las pruebas del producto terminado son potencia relativa in vivo, determinación de la concentración de aluminio por espectroscopía de absorción atómica, seguridad, esterilidad, pH, cloruro de sodio por electrodo ion-selectivo, cloruro de bencetonio por titulación y una prueba de límite para formaldehído usando espectroscopía UV-Vis. Si bien no existe una guía específica sobre la inclusión de métodos de prueba que sean indicadores de potencia, exis- ten paralelos que pueden extraerse del Consejo Internacional de Armonización (ICH) Q5E Comparabilidad de productos biotecnológicos / biológicos sujetos a cambios en su proceso de fabricación (22). La guía establece que “el fabri- cante debe considerar las limitaciones de los ensayos biológicos, tales como la alta variabilidad, que podrían evitar la detección de diferencias que se produ- cen como resultado de un cambio en el proceso de fabricación”. Sin embargo, también establece: “En los casos en que el ensayo también sirve como complemento al análisis fisicoquímico (p. ej., como un ensayo sustituto para una estructura de orden superior), el uso de un ensayo biológico relevante con la precisión y exactitud adecuadas podría proporcionar un enfoque ade- cuado para confirmar que el cambio en la estructura específica de orden superior no ocurrió después de los cambios en el proceso de fabricación”. Si bien la intención de este análisis es evaluar la estabilidad en lugar del cam- bio de fabricación, esta guía se puede extrapolar a los métodos de prueba de estabilidad. Si los métodos de potencia carecen de suficiente exactitud y pre- cisión para detectar pequeños cambios físicos y químicos que ocurren durante el almacenamiento, se pueden requerir métodos adicionales para proporcionar una indicación temprana de pérdida de potencia y caducidad. Stanley Hem abogó por la aplicación de estudios de preformulación, comunes en el desarrollo de productos biofarma- céuticos, a las vacunas que contienen adyuvantes de aluminio (23). Además de caracterizar el adyuvante y el antígeno libre, Hem recomienda la evaluación de la formulación adyuvante del antígeno para comprender la fuerza de la adsor- ción, así como la estabilidad estructural y química de los antígenos proteicos. Métodos de prueba Idealmente, los métodos de prueba para proporcionar datos de estabilidad para productos de vacuna adsorbidos no requerirían una preparación de muestra extensa o la desorción del antígeno del adyuvante. Hay una variedad de mecanismos diferentes adecuados para la desorción, pero todos comparten desventajas. El procedimiento de desorción en sí mismo puede provocar cambios estruc- turales o modificaciones adicionales o impurezas en el antígeno proteico. Para el análisis en la mayoría de los métodos de prueba, las muestras desorbidas requerirán un paso de intercambio de tampón, lo que dará como resultado soluciones con una concentración desconocida, que debe determinarse utilizando un ensayo separado antes del análisis mediante métodos de in- dicación de estabilidad. Por último, la recuperación de la desorción puede variar y la recuperación puede disminuir en muestras envejecidas (15, 24). La medición del antígeno no unido por su definición se realiza en un medi- camento terminado (FDP) sin desorción. La intención del método de prueba es medir la cantidad de proteína libre que no se adsorbió o se desorbió del adyuvante de aluminio. Las muestras se preparan por centrifugación, y se re retira el sobrenadante para su análisis. Típicamente, la cromatografía se utiliza para cuantificar la cantidad de proteína libre en la muestra contra una curva estándar de la misma proteína. Las metodologías cromatográficas varían y pueden incluir cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (25) o cromatografía líquida de alto rendi- miento en fase reversa (RP-HPLC). Los métodos típicos pueden basarse en los utilizados para el análisis del principio activo de antígeno a granel (BDS), que