Pharmaceutical Technology Ed. 163

30 Edición Sudamérica 2020 - N º163 Pharmaceutical Techno logy Curva estándar de O-ftalaldehído (OPA) para la vacuna modelo FIGURA 1 luego se optimizan para la sensibilidad y se validan utilizando una curva estándar de bajo nivel. Algunos métodos de prueba inmunológica son factibles en presencia de Alhydrogel o fosfato de aluminio y pueden usarse para identificación o, en algunos casos, cuantificación sin desorción. Si bien los Western Blots no son una alternativa práctica porque SDS-PAGE no se puede realizar en FDP, los las transferencia de ranuras (slot blot) o puntos (dot-blot) eliminan el paso de separación. En un método de slot-blot o dot-blot, el producto se aplica directamente a una mem- brana y se puede pasar a través de la membrana utilizando un aparato de microfiltración y vacío. Se pueden realizar enjuagues adicionales según sea necesario para garantizar que no quede ningún residuo superficial en la membrana. Después de la aplicación de muestras, estándares y controles a la membrana, la membrana se retira del aparato y se lleva a cabo la inmunotransferencia usando procedimientos estándar. Aunque no se identificaron procedimientos publicados que describan el uso de dot-blot o slot-blot para el análisis de vacunas adsorbidas en aluminio, la técnica se usó para cuantificar la Hemaglutinina y las Neuraminidasa en la vacuna contra la influenza (26). Una ventaja de dot-blot o slot-blot es que se pueden analizar múltiples muestras simultáneamente, y las membranas se pueden cortar en tiras para inmuno- transferencia usando múltiples anticuerpos que permiten la identificación de múltiples antígenos simultáneamente. Zhu demostró la viabilidad de un inmunoensayo directo de formulación de Alhydrogel (DAFIA) para la determinación de la identidad y el contenido del antígeno (27). En el método, el FDP se agrega a los pocillos de una placa negra de múltiples títulos. Después de la centrifugación y el lavado, los pocillos se bloquean, luego se sondean con un anticuerpo primario seguido de un anticuerpo secundario marcado con fluoresceína. La señal se lee con un fluorómetro a 485 nm / 535 nm. La medición de la concentración del adyuvante de aluminio se puede determinar directamente, utilizando espectroscopía de emisión atómica de plasma acoplada inductivamente (ICP-AES). Los métodos tradicionales para la cuantificación de proteínas como la espectroscopía UV-Vis o RP-HPLC no son adecuados para los antígenos unidos. El método 6 de USP <1057> que utiliza o-ftalaldehído (OPA) (21) se ha aplicado a las vacunas de Alhydrogel. El OPA reacciona con los grupos amina N-terminales o los grupos amina en las cadenas late- rales de lisina y produce una señal fluorescente a 340 nm/455 nm. La concentración de proteínas del FDP se compara con una curva estándar. El método OPA se aplicó a los candidatos a la vacuna contra la malaria que contenían Alhydrogel, y se determinó que para obtener resultados precisos, Alhydrogel debe incluirse en los estándares a una concentración equivalente como muestras (28). La exactitud fue de 87 a 100% y la linealidad, aunque dependiente de proteínas, varió de 25 a 400 µg/ml. En estu- dios internos, el método tuvo un intervalo de 20–250 µg/mL usando un ajuste de curva no lineal y resultó en una exactitud de 98–110% y una reproducibilidad de ≤ 2% para muestras (véase una curva estándar representativa en la Figura 1). La HPLC no es adecuada para el análisis de FDP intacto ad- sorbido en aluminio porque las moléculas de la vacuna serían filtradas por la frita de la columna o, si pasan a la columna, se obstruiría la columna y aumentaría la contrapresión. RP-HPLC se ha aplicado a la medición de concentración y, hasta cierto punto, a la estabilidad química de las vacunas después de la desorción (10). Si bien se requiere un paso de desorción para realizar el análisis cromatográfico del antígeno intacto, el ma- peo de péptidos proporciona una herramienta poderosa para verificar la identidad de FDP y evaluar la estabilidad química del antígeno después de la adsorción y durante la estabilidad. En el mapeo de péptidos, la proteína se digiere con una enzima como Lis C o Tropsina para producir un conjunto de péptidos. La mezcla resultante de péptidos puede separarse cromatográficamente y compararse visualmente con un con- trol o el BDS o puede analizarse por espectrometría de masas y compararse con las masas esperadas de péptidos basadas en la secuencia primaria. La mezcla de péptidos también se puede analizar sin separación utilizando la espectrometría de masa con desorción láser asistida por matriz con detección de tiempo de vuelo (MALDI-TOF). La digestión con Lys C de los antígenos desorbidos seguido del análisis MALD-TOF de una vacuna botulínica trivalente que contiene Alhydrogel detectó reacciones de oxidación y desamidación en los tres antíge- nos proteicos y las velocidades de reacción se aceleraron en presencia del adyuvante (29). Inicialmente, se utilizó un tampón de succinato 250 mM, pH 3,5 para desorber las muestras, pero después de la incuba- ción, la desorción se volvió más difícil, y se requirió el uso de un tampón de urea 4 M pH 7,5. La desorción en sí complica el análisis porque, en primer lugar, puede no ser completamente reproducible, especialmente para muestras envejecidas y, en segundo lugar, puede provocar una degradación adicional. En estudios no publicados, la tripsina se usó para digerir con éxito el antígeno unido a Alhydrogel sin desorción. Los proce- dimientos de digestión estándar de incubación en tampón Tris/ HCL, pH 8,0 durante cuatro horas a 37°C fueron seguidos por RP-HPLC usando una fase móvil ACN/TFA y una columna C18. Visualmente, los cromatogramas (Figura 2) de FDP digerido coincidían estrechamente con los de BDS digerido, lo que indica que el mapeo de péptidos no desorbidos es un método factible para la evaluación de la estabilidad del antígeno en FDP. Con la mayor disponibilidad de espectrómetros de masas de alta exactitud/alta resolución, el mapeo de péptidos ha evolucionado hacia métodos de múltiples atributos (MAM), que pueden reemplazar múltiples métodos indicativos de esta- Fluorescencia (RFU) Concentración de proteína (µg/mL) Curva estándar de OPA Placa 1 Placa 2