Pharmaceutical Technology Ed. 163

32 Edición Sudamérica 2020 - N º163 Pharmaceutical Techno logy bilidad electroforética y cromatográfica para proteínas terapéuticas (30). La aplicación de MAM a las vacunas adsor- bidas en aluminio tiene la oportunidad de conocer mejor la estabilidad del antígeno proteico y mejorar el análisis para respaldar la calidad mediante el diseño (QbD) y el control de calidad (QC). MAM tiene el potencial de reempla- zar los métodos indicadores de estabi- lidad electroforéticos y cromatográficos que requieren desorción antes del aná- lisis. Los métodos de desorción varían desde el uso de tampón fosfato pH 7,4 (25), tampón fosfato y Zwittergent (9), tampón succinato 250 mM pH 3,5 (29) hasta condiciones más duras como dodecil sulfato sódico (SDS) 20 mM o cloruro de cetilpiridio 20 mM en tampón citrato-fosfato (31) y hasta 4 M de urea (29). Varios investigadores han señalado que la desorción es más difícil en mues- tras envejecidas (14, 24). Por lo tanto, el desarrollo de procedimientos de desorción para métodos indicadores de estabilidad debe realizarse con mues- tras envejecidas cuando sea posible. La selección del método de desorción variará según el adyuvante utilizado, así como el método de análisis previsto y la compatibilidad con la solución de desorción. Por ejemplo, SDS sería una buena opción para el tampón de desor- ción al preparar muestras para métodos que utilizan SDS en el procedimiento, como SDS-PAGE o CE-PAGE. Además, SDS no interfiere significativamente con los procedimientos RP-HPLC. La urea se usa a menudo en la preparación de muestras para procedimientos de elec- troforesis capilar de imagen (ICE) y es un tampón preferido para la preparación de muestras para métodos de separación de carga como ICE y cromatografía de intercambio iónico (IEX). Un protocolo estándar para la desor- ción usando SDS incluía los siguientes pasos: • Mezclar el tampón, SDS y la vacuna FDP e incube a 70°C durante 10 minutos. • Centrifugar, eliminar el sobrenadante y determinar la concentración de proteína utilizando RP-HPLC. • Asegurarse de que la concentración de SDS en el estándar de referencia coincida con la de las muestras. • Concentrar usando filtros giratorios y desalar con lavado con agua. Uti- lizar el volumen para determinar la concentración aproximada antes del análisis. Un protocolo estándar para la des- orción de urea sigue un procedimiento similar: • Mezclar el tampón, la urea y la va- cuna FDP y agitar durante 18 horas en condiciones refrigeradas. • Centrifugar, eliminar el sobrenadante y determinar la concentración de proteína utilizando RP-HPLC. Asegú- rese de que la concentración de urea en el estándar de referencia coincida con la de las muestras. • Dializar las muestras para reducir la concentración de urea. • Repetir el análisis RP-HPLC para determinar la concentración, con- centrar usando filtros giratorios y desalar con lavado con agua. • Realizar análisis ICE o IEX. Después de la desorción, SDS-PAGE se puede realizar utilizando procedi- mientos estándar y geles y reactivos comerciales. El análisis de una vacuna modelo representada en la Figura 3 utilizó un gel prefabricado (Thermo Invitrogen NuPAGE 4–12% Bis-Tris) con muestras recomendadas y tampones en ejecución (Tampón de muestra NuPAGE y Tampón de corrida NuPAGE MOPS SDS). El gel muestra resultados del análisis de muestras de vacunas modelo FIGURA 2 Cromatogramas UV de 220 nm de BDS no digerido (azul), BDS digerido (rojo), medicamento terminado digerido (FDP) (verde), blanco de BDS (fucsia), blanco de FDP (azul) y blanco de tripsina (violeta). 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 -50 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 -50 Minutos mAU