La atrofia muscular espinal (AME) es una enfermedad neurodegenerativa infrecuente que afecta a las neuronas motoras y es causada por mutaciones en las dos copias del gen SMN1. Aunque hay diferentes tipos de AME, determinados por la gravedad de la patología y el momento de aparición de los síntomas, esta enfermedad se caracteriza por una progresiva pérdida de la fuerza muscular y puede afectar la posibilidad de hablar, caminar, tragar y hasta de respirar.

Hasta fines de 2016, los tratamientos disponibles para AME eran únicamente de sostén, y no había ninguna terapia farmacológica que permitiera frenar o enlentecer el avance de la enfermedad. Esta situación cambió cuando en diciembre de aquel año la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA, por sus siglas en inglés) autorizó el uso de un medicamento conocido como nusinersen, que luego también fue aprobado en la Argentina. Este fármaco tiene como blanco al gen SMN2 -muy similar al SMN1- y fue desarrollado por el uruguayo Adrián Krainer, investigador del Cold Spring Harbor Laboratory de Nueva York. La administración de nusinersen a los pacientes con AME permite aumentar la producción de la proteína SMN y así detener o enlentecer la muerte progresiva de las neuronas motoras.

Una reciente investigación encabezada por científicos del CONICET sugiere, a partir de ensayos in vitro e in vivo, que los resultados del tratamiento con nusinersen podrían optimizarse si se combinan con la administración de ácido valproico, un fármaco que tiene la función de inhibir la histona desacetilasa y que actualmente se utiliza para tratar casos de epilepsia. El trabajo dirigido por Alberto Kornblihtt, investigador del CONICET en el Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias (IFIBYNE, CONICET-UBA), fue publicado en la revista Cell y escogido para la ilustrar la tapa de la prestigiosa revista científica.

La atrofia muscular espinal y el splicing alternativo del gen SMN2

El gen SMN2, blanco terapéutico de nusinersen, se diferencia de SMN1 únicamente en 11 pares de bases, sobre un total de aproximadamente 30 mil. Sin embargo, la diferencia en un único par de bases en el exón 7 lleva a que cuando SMN2 se transcribe desde el ADN al ARNm maduro, este exón sea mayoritariamente omitido -fenómeno que se conoce como splicing alternativo-, y que, como consecuencia, la cantidad de proteína SMN que se sintetiza sea insuficiente. Por este motivo, la presencia de SMN2 en el genoma humano no puede compensar las mutaciones en el gen SMN1 que tienen los pacientes con AME. No obstante, es la existencia del gen SMN2 lo que permite que los fetos con mutaciones en los dos alelos del gen SMN1 lleguen a término. “De lo contrario, las mutaciones en SMN1 causarían directamente la letalidad embrionaria, tal como sucede en ratones, animales que no tiene el gen SMN2”, explica Luciano Marasco, becario doctoral del CONICET en el IFIBYNE y primer autor del trabajo.

Nusinersen es un oligonucleótido antisentido (ASO) que permite aumentar la inclusión del exón 7 en la transcripción del gen SMN2 y, consiguientemente, aumentar la producción de proteína SMN para suplir la ausencia del gen SMN1. Es decir, la acción de nusinersen consiste en corregir el splicing alternativo de SMN2 para obtener mayores cantidades de la proteína SMN. Al administrarse directamente en el líquido cefalorraquídeo, el ASO corrige el splicing alternativo de SMN2, principalmente, a nivel del sistema nervioso central.

Poco antes de la aprobación de este fármaco por parte del ente regulador estadounidense, familiares de pacientes con AME agrupados en Familias AME Argentina (FAME Argentina) acudieron al laboratorio de Kornblihtt, con amplia experiencia en el estudio de los mecanismos que regulan el splicing, para solicitarle que investigara el tema desde el punto de vista de la ciencia básica. “Siempre tuvimos el sueño de que el tema se investigue en nuestro país. Veíamos que las grandes investigaciones se llevaban a cabo en Estados Unidos, Europa o Canadá, y aunque esos avances eran muy importantes para nosotros, al mismo tiempo nos sentíamos lejos. Consideramos que Kornblihtt era la persona adecuada porque conocíamos su trayectoria en el estudio del splicing y sabíamos que tenía contacto con Adrián Krainer, quien había descubierto el mecanismo que se utilizó para el primer tratamiento de AME. Nosotros apostamos a una investigación en ciencia básica porque entendemos que cuanto más se conozca sobre el tema, aumentan las posibilidades de que se desarrollen mejores terapias”, afirma Vanina Sánchez, presidenta de FAME Argentina.

Luego de comprobar que el splicing alternativo de SMN2 cambia de acuerdo con la velocidad de la transcripción (el exón 7 se incluye menos en el ARNm maduro si la transcripción es lenta y más si la transcripción es rápida), paradigma del splicing que su laboratorio estudia hace muchos años, Kornblihtt aceptó la propuesta pero advirtió que la investigación podía no arrojar resultados satisfactorios.

Una posible terapia combinada

“A nosotros se nos ocurrió que si la inclusión del exón 7 del gen SMN2 aumentaba junto con la velocidad de la transcripción, al usar drogas que abrieran la cromatina del gen, la enzima responsable de la transcripción -la ARN polimerasa- iría más rápido y, por lo tanto, contribuiría con nusinersen en el mejoramiento de la inclusión del exón 7 y en el incremento de la producción de la proteína SMN. Parte del objetivo era que esto no sucediera solo en el sistema nervioso central, que es donde actúan principalmente las inyecciones de nusinersen, sino también en tejidos periféricos en los que también se expresa SMN2”, explica Kornblihtt, que es también profesor emérito del Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires (FCEN, UBA).

“Primero usamos minigenes artificiales para ver cómo interaccionaba nusinersen con los inhibidores de la histona desacetilasa, que lo que hacen es abrir la cromatina. Luego continuamos trabajando con el gen endógeno SMN2 en células en cultivo, siempre apuntando a aumentar la isoforma saludable del gen en el ARNm maduro y a producir mayores cantidades de la proteína SMN”, relata Marasco.

Luego de realizar promisorios ensayos en cultivos celulares, Marasco se trasladó al laboratorio de Krainer en Nueva York, para probar los efectos de la combinación de fármacos en ratones modelos de la enfermedad que tiene incorporado el SMN2 humano.

Los trabajos con ratones apuntaron también a aumentar la expresión de la isoforma sana del SMN2 en el ARNm maduro, así como la expresión de la proteína en todos los órganos. Los resultados de estos ensayos con modelos animales superaron las expectativas del equipo de investigación. “Los ratones con AME a los que se les suministra de forma combinada el ASO (nusinersen) con un inhibidor de la histona desacetilasa, como el ácido valproico, tienen mayor sobrevida, ganan más peso y tienen mejores propiedades motoras y más fuerza en las extremidades anteriores que los ratones a los que se les administra solo el ASO. Si se los voltea, los ratones tratados únicamente con nusinersen demoran en darse vuelta, pero aquellos tratados con la combinación de los dos fármacos lo hacen de forma inmediata”, señala Marasco. Kornblihtt agregó que “aunque hubo otros grupos que probaron esta combinación, nadie había explorado el mecanismo molecular ni lo había hecho hasta ahora con modelos animales, sino, únicamente, en cultivos celulares”.

Los investigadores también probaron combinar el ASO con otro inhibidor de la histona desacetilasa, como la tricostatina, con similares resultados, pero a diferencia de la tricostatina el ácido valproico ya está aprobado para uso clínico.

Por otro lado, el equipo de investigación constató que los ratones tratados solamente con ácido valproico mueren a los siete días, al igual que sucede con los ratones control tratados con solución fisiológica. Es decir, en ensayos in vivo, solo al combinarse con el ASO la acción del inhibidor de la histona desacetilasa tiene efectos relevantes.

Un descubrimiento relevante

Además de comprobar en ratones con AME que la apertura de la cromatina del gen SMN2 mejora el efecto terapéutico del nusinersen, al favorecer una mayor inclusión del exón 7 en el ARNn maduro, los investigadores descubrieron también que este fármaco tiene el efecto de compactar la cromatina y, por lo tanto, de enlentecer la velocidad de la transcripción. Esta acción del ASO va justamente en el sentido opuesto del que se busca, ya que contribuye a inhibir la inclusión del exón 7 en la transcripción del gen SMN2.

“Ese mecanismo es totalmente novedoso, porque nadie de los que trabaja con ASOs en distintas enfermedades imaginó ni demostró que estas terapias con ASOs pueden modificar la cromatina. En otros genes, esta modificación podría ser, como en este caso, opuesta al efecto deseado, pero también podría ser sinérgica”, afirma Kornblihtt. En la continuación de este hallazgo sigue trabajando Jose Stigliano, becario doctoral del CONICET en el grupo de Kornblihtt y también co-autor del trabajo en Cell. “Lo que hace el ácido valproico es justamente compensar el efecto secundario que tiene el ASO. Pero hay que decir que, más allá de este efecto secundario que buscamos corregir, la terapia es super buena”, afirma Marasco.

Adicionalmente, los investigadores corroboraron que esta terapia combinada no tiene efectos deletéreos sobre el genoma. “Los estudios demostraron que de 15 mil genes que analizamos, solo afecta a unos 60, un número muy poco significativo”, señala Kornblihtt.

Tanto los investigadores como las familiares reunidos en FAME tienen la expectativa de que eventualmente, y con los estudios previos que haya que hacer, la combinación de nusinersen y ácido valproico pueda ser puesta a prueba en ensayos clínicos. “Esperamos que, a partir de la publicación de este estudio, aparezcan grupos interesados en poner a prueba la terapia en humanos. No es sencillo porque se trata de una enfermedad muy poco frecuente. Pero creo que hemos aportado una semilla importante, no solo al conocimiento de esta enfermedad, sino también de cómo funcionan los ASOs”, afirma Marasco.

Fuente: CONICET